АВТОМАТИЧЕСКИЙ ОТБОР ПРОБ КРОВИ И ПРИНЦИПЫ ЭТИЧЕСКОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ЖИВОТНЫХ В НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЯХ (3RS)

article description image

            Начиная с середины 1990-х годов системы автоматического отбора проб крови (АОПК) начали все чаще применять в биомедицинских исследованиях для изучения фармакокинетики, фармакологической безопасности лекарственных средств, метаболизма, биологических маркеров и в других областях науки и производства. Целью данной статьи было сократить количество животных и уменьшить их стресс при проведении научных исследований, а также оценить вклад систем АОПК в принципы этического использования животных, впервые изложенные Russell и Burch (1) (3Rs-принципы).

 История вопроса

            Традиционно, кровь животных для различных научных целей отбирают непосредственно из кровеносной системы шприцем или другими способами, такими как декапитация (см. www.nc3rs.org.uk/bloodsamplingmicrosite). При этом для уменьшения боли и/или стресса используют обезболивание, за исключением тех случаев, когда оно приводит к большему риску для животного, чем получение образцов крови. Хотя данные методы отбора проб еще применяют в настоящее время, все больше лабораторий пользуются постоянными хирургически имплантированными катетерами или портами сосудистого доступа (см. Глоссарий), особенно когда требуется получить несколько образцов крови от одного и того же животного (2-5).

            В начале 1990-х годов DiLab обратился к компании Novo Nordisk для разработки способа, позволяющего автоматизировать процесс отбора проб крови у крыс с целью сократить количество животных в эксперименте и стресс, вызванный многократными манипуляциями, ограничением подвижности и инвазивными процедурами. Несколько лет спустя было представлено первое коммерческое устройство AccuSampler® (рис. 1). В последующие годы в продаже появились устройства других производителей.

 

Рис. 1. Мышь, подключенная к AccuSampler® через катетер. Для защиты катетера и выносящей магистрали используется пружинный поводок, который ведет к шарнирному соединению (свивелу). Свивел установлен на одноплечий рычаг, который уравновешивается пружиной.

             На сегодняшний день системы АОПК используют для отбора проб крови у многих видов животных, включая мышей, крыс, хомяков, морских свинок, собак породы бигль, мини-свиней и макак.

            По данным работ (6-9) при применении систем АОПК:

  • в образцах крови наблюдаются более низкие концентрации различных стресс-маркеров, таких как кортикостероиды и глюкоза;
  • для исследований требуется меньше животных;
  • экспериментальные данные более достоверные;
  • сокращение времени исследований и количества персонала в лаборатории позволяет ознакомиться с альтернативными лабораторными методами и процедурами и увеличить производительность.

 Процесс АОПК

            Отбор проб крови можно автоматизировать, если хорошо понимать физические основы движения жидкости через трубки и кровеносные сосуды различных диаметров и соблюдать биологических ограничения, при которых у животных поддерживаются нормальные физиологические параметры в процессе отбора крови (10). Сначала, независимо от вида животного, у которого будут брать кровь, подготавливают доступ к требуемому кровеносному сосуду с помощью использования хирургически имплантированного катетера или порта сосудистого доступа. Как правило, катетеры применяют для небольших животных (например, грызунов) и исследований продолжительностью 24-48 ч. У крыс катетер обычно имплантируют в яремную вену или сонную артерию, но также используют и другие сосуды (например, портальную вену, бедренную артерию). Порт сосудистого доступа обычно применяют для крупных животных (например, собак, свиней и макак) или если по протоколу исследований требуется долгосрочное использование животного.

            Процедуры имплантации катетера проводят под общей анестезией и в асептических или стерильных условиях. После операции животным вводят анальгетики, чтобы уменьшить боль. До начала исследований предусмотрен восстановительный период (8, 11, 12). В этот период закупорку катетеров предотвращают (Патент) или периодической промывкой гепаринизированным физиологическим раствором, или путем заполнения катетера слегка вязким раствором, содержащим антикоагулянт (например, гепаринизированным глицерином).

            Все чаще животным имплантируют многоцелевые катетеры, позволяющие вводить исследуемые препараты в дополнение к отбору проб крови (2, 7, 9, 13 ,14) без многократных манипуляций, ограничения подвижности и инвазивных процедур, которые могут привести к увеличению стресса и боли у животного (см. Принцип оптимизации).

            Системы АОПК содержат один или несколько насосов и клапанов, предназначенных для прямого отбора проб крови в охлажденные пробирки, а также для промывания катетера и возвращения жидкости животному (рис. 2). Для большинства исследований систему заполняют стерильным гепаринизированным физиологическим раствором (приблизительно 20 МЕ/мл). До начала эксперимента животное держат на привязи, которая позволяет ему двигаться так же свободно, как в домашней клетке, но в то же время препятствует выдергиванию катетера, его повреждению или инфицированию входного отверстия (рис. 1).

 

Рис. 2. Схема отбора крови с использованием AccuSampler®. С помощью этого конкретного устройства, пузырьки воздуха используются для предотвращения смешивания крови и физиологического раствора в системе трубок. 

            Автоматическая система означает, что определенные объемы крови могут быть отобраны в запрограммированное время. На первом этапе кровь отбирается через катетер в систему трубок устройства АОПК. Поскольку трубки и катетер заполнены физиологическим раствором, первый отобранный объем крови смешивается с физиологическим раствором и, следовательно, разбавлен. Этот первоначальный объем или сливается в отходы, или возвращается обратно животному. Поэтому, при сравнении данных, полученных от катетеризированных животных с помощью систем АОПК и данных, полученных при непосредственном отборе крови из сосуда пункцией, следует учитывать, что концентрация крови катетеризированных животных может быть на 5-15% ниже из-за первоначального смешивания с физиологическим раствором в катетере. Это может быть сведено к минимуму за счет увеличения объемов проб, в том числе отбором больших объемов проб до получения образца с нужными параметрами.

            На втором этапе образец переносится в охлажденную пробирку. Процедура отбора проб завершается промыванием системы физиологическим раствором, чтобы уменьшить возможность переноса препарата от образца к образцу. Объем физиологического раствора, эквивалентный объему отобранного образца крови, возвращается животному для поддержания надлежащего жидкостного баланса. В большинстве случаев при таком замещении жидкости нет необходимости в использовании дополнительных животных для доставки донорской крови (см. Принцип сокращения количества животных в эксперименте). По протоколу АОПК для поддержания проходимости катетера его периодически промывают небольшим количеством гепаринизированного физиологического раствора (10-20 мкл).

 

Автоматический отбор проб крови и принципы этического использования животных в научных исследованиях (3Rs)

Системы АОПК могут потенциально способствовать двум из трех принципов, а именно оптимизации воздействия на животного и сокращению количества животных в эксперименте.

Принцип оптимизации

            В научной литературе широко освещено воздействие манипуляций, ограничения подвижности и отбора крови у лабораторных животных, включая увеличение частоты сердечных сокращений и кровяного давления, повышение концентрации гормонов, таких как кортикостерон, и изменения в реакции иммунной системы (15). Наблюдаемые сдвиги в физиологических параметрах означают, что эти процедуры являются стрессовыми для животных и могут вносить искажающие факторы в научные данные, потенциально уменьшая достоверность исследования.

            Процедура АОПК менее стрессовая для животного и позволяет получить более точные данные, чем при отборе крови вручную, за счет избегания многократных манипуляций, ограничения подвижности и возможной боли и/или дискомфорта от повторной анестезии и/или сосудистой пункции (6). Это особенно актуально, когда требуется много образцов от одного и того же животного. Хотя было очень мало исследований, изучающих оптимизационный потенциал систем АОПК, Royo с соавт. обнаружили, что при отборе крови с помощью AccuSampler® у самцов крыс линии Спрег-Доули не происходит высвобождения кортикостерона (8).

            Использование систем АОПК вызывает озабоченность с точки зрения гуманного обращения с животными, главным образом потому, что требуется инвазивная процедура для установки катетера и подключения животного к устройству, а также хирургическая анестезия ‑ хорошо известный фактор стресса у грызунов и других лабораторных животных (3, 14, 16-21). По данным Royo с соавт. после имплантации катетера в яремную вену крыс под общей анестезией изофлураном с целью присоединения к системе AccuSampler® наблюдался стресс-ответ (характеризующийся увеличением общего высвобождения кортикостерона и увеличением фекальных метаболитов иммунореактивного кортикостерона). Однако крысы быстро восстановились. Это означает, что на результаты, полученные с использованием систем АОПК в фармакологических и физиологических исследованиях, не может повлиять острая стрессовая реакция животных после операции.

            Отбор проб с помощью постоянного катетера обычно считается менее стрессовым способом и вызывает меньше изменений в показателях крови, чем отбор крови шприцем, с анестезией или без нее (22-24). При сравнении современных методов отбора проб крови можно выделить более предпочтительные. Например, Fluttert с соавт. (25) получили близкие значения концентрации кортикостерона в образцах крови, собранной катетером из яремной вены и полученной осторожным выдавливанием из разреза боковой хвостовой вены (хвостовой надрез) у крыс. Однако, Vahl с соавт. (26) обнаружили, что концентрация адренокортикотропного гормона (АКТГ) была больше в крови, собранной из хвостового надреза, по сравнению с кровью, полученной при катетеризации нижней полой вены. Возможно, это связано с тем, что требуется больше времени для получения крови из хвостовой вены. Не известно, есть ли различия в концентрациях кортикостерона или АКТГ в образцах, отобранных непосредственно через катетер или через систему АОПК.

            Венозные катетеры облегчают повторный отбор проб, особенно в тех случаях, когда необходим отбор больших объемов крови. Отбор трех или более миллилитров крови у крыс за короткий промежуток времени приводит к увеличению концентрации кортикостерона в плазме крови (3). Наличие венозного катетера позволяет либо сделать переливание донорской крови (27), либо возместить ее суспендированными в стерильном физиологическом растворе эритроцитами, что предотвратит гиповолемию и анемию (см. Глоссарий) во время повторного отбора проб. AccuSampler® компенсирует количество отобранной крови путем восполнения тем же объемом физиологического раствора для поддержания жидкостного баланса.

            Постоянные венозные катетеры могут быть связаны с такими осложнениями у грызунов, как септический тромбофлебит и генерализованный сепсис (см. Глоссарий). Этого можно в какой-то степени избежать, соблюдая принципы стерильности в хирургии (23, 28). Представляется справедливым беспокойство, что вживление и наличие катетера само по себе является источником хронического раздражения или воспаления (2, 11). Тщательный выбор материала катетеров, «замка» катетера (см. Глоссарий) и места катетеризации могут помочь решить эти проблемы (12, 29, 30).

            У длительно катетеризированных животных, особенно мелких видов (например, крыс), подвижность, в той или иной степени, ограничена шлейкой, свивелом и поводком, через которые проходит катетер, в том числе и при использовании системы AccuSampler® (см. рис. 1 и 3). По данным работы (31) одевание шлейки вызывает стресс у крыс, а привязывание ограничивает нормальные движения животных. Кроме того, катетеризированные и привязанные животные обычно размещаются поодиночке на всем протяжении исследования, чтобы предотвратить возможное повреждение катетера соседями по клетке (25, 26). Таким образом, это увеличивает стресс и плохую переносимость процедур (23). Если необходимо одиночное содержание животного, оно должно включать элементы обеспечения поведенческих потребностей животного, такие как подстилка и жевательные блоки для грызунов.

            В заключение следует отметить, что возможности оптимизации воздействия на животных с помощью систем АОПК недостаточно изучены и, скорее всего, будут зависеть от конкретных условий проведения исследования (например, от требуемого количества, объема и качества образцов крови). Поэтому важно провести полностью контролируемое сравнение последствий применения систем АОПК и обычных методов сбора крови вручную для здоровья животных. Чтобы сделать такое сравнение, должен быть надлежащим образом получен ряд показателей состояния животных, в том числе частота сердечных сокращений, кровяное давление и температура с использованием телеметрии (32), уровень гормонов в плазме, моче или фекалиях, вес тела и поведение.

 

Рис. 3. Шлейка для крыс. Аналогичные шлейки доступны для других видов.

 

Принцип сокращения количества животных в эксперименте

            При использовании систем АОПК в зависимости от экспериментальной модели и протокола исследований может быть достигнуто значительное сокращение использования животных (например, 50-80%), что одновременно является этичными и выгодным финансово. Например, при проведении некоторых видов исследований на мышах требуются отбор крови в шести-восьми временных точках. При отборе крови вручную для этих исследований обычно требуется 18-24 мышей, по сравнению с тремя мышами, которые необходимы при использовании систем АОПК. Традиционно при отборе проб вручную в одну временную точку у мыши берется только один образец, часто через сердечную пункцию. При применении АОПК образцы крови во всех шести-восьми временных точках могут быть взяты у одной и той же мыши, поскольку система может манипулировать с очень маленькими объемами образцов (например, 5-50 мкл), что невозможно при отборе проб вручную.

            Кроме того, количество животных может быть дополнительно уменьшено за счет использования одного и того же животного в нескольких исследованиях, при условии, что требования к эксперименту соответствуют индивидуально установленным рекомендациям по количеству отобранной в определенные временные точки крови. Как только имплантирован катетер, очень легко повторно отбирать небольшие объемы крови, используя систему АОПК. Одним из таких примеров является перекрестное исследование, где тестируемый препарат вводят животному внутривенно и после соответствующего периода выведения вещества из организма и восстановления, животному снова вводят тот же препарат перорально (9). Другая возможность ‑ использование одного и того же животного и в контрольном исследовании, и в опыте. Например, толерантность к глюкозе можно изучать на одном и том же животном в отсутствие тестируемого препарата и затем, после периода восстановления, в присутствии препарата. Системы АОПК могут также устранить потребность в донорских животных, кровь которых используют для поддержания жидкостного баланса у экспериментального животного.

            Снижение стресса от манипуляций вместе с роботизированным подключением системы АОПК делают воспроизводимой скорость потока крови. Это значит, что коэффициенты вариации в исследованиях фармакокинетики и метаболизма обычно улучшаются при использовании АОПК по сравнению с отбором крови вручную. Кроме того, поскольку животные не подвергаются манипуляциям и свободно перемещаются (хотя и на поводке), могут быть определены физиологические уровни стресс-маркеров, таких как кортикостероиды, АКТГ и кортизол. Более низкие физиологические базовые показатели этих стрессовых гормонов не вызывают нарушений метаболизма в тестовых образцах. Обнаружено, что у животных, подключенных к системе АОПК, даже такой простой показатель, как концентрация глюкозы в крови, значительно ниже, чем у животных, у которых отбирали кровь венозной пункцией (неопубликованные данные).

            Сокращение количества животных также может быть достигнуто в области исследований фармакологической безопасности, где физиологические параметры (такие как давление крови и частота сердечных сокращений) контролируются с помощью телеметрии и затем соотносятся с количеством введенного препарата. Традиционно, для этого должно потребоваться два отдельных исследования, так как на физиологические параметры животного сильно повлияет стресс-ответ, связанный с манипуляциями и ограничением подвижности для отбора крови вручную. Системы АОПК позволяют проводить оба исследования у одного и того же животного, тем самым уменьшая количество животных и обеспечивая более качественные данные за счет исключения влияния изменчивости между животными, поскольку все параметры измеряются у одного и того же животного.

            При разработке доклинических исследований препаратов важны время и труд, затраченные на получение серийной выборки небольших объемов крови от мелких животных  (например, крыс) на протяжении всего периода фармакокинетических исследований. Использование систем АОПК может ускорить этот процесс и даст возможность увеличить производительность при скрининге. Несмотря на то, что в целом это может привести к увеличению количества использованных в экспериментах животных, в результате обычно происходит более быстрый скрининг препаратов, ожидающих проверки, а не увеличение их количества.

Заключение

            Системы АОПК имеют ряд преимуществ по сравнению с методами отбора проб крови вручную, в том числе улучшение качества данных, сокращение количества использованных в эксперименте животных, возможность снижения стресса у животных в процессе отбора проб, экономия времени и ресурсов персонала. Для каждого отдельного эксперимента эти преимущества должны быть соотнесены с необходимостью подвергать животных хирургическим манипуляциям под анестезией и содержать на привязи в одиночной клетке.

 

Благодарность

Мы хотели бы поблагодарить Dr Mark Presco из NC3Rs за его вклад и помощь в написании раздела «Принцип оптимизации».

 Глоссарий

Анемия: снижение ниже нормы количества или объема эритроцитов или количества гемоглобина в крови.

Катетер: инструмент в виде трубки, предназначенный для введения жидкости в полости тела и сосуды или ее выведения.

Кортикостерон: стероидный гормон коры надпочечников, который отвечает за регулирование белкового и углеводного обмена и участвует в стрессорной реакции у грызунов.

Гиповолемия: аномальное уменьшение объема циркулирующей жидкости (плазмы) в организме.

 «Замок» катетера: раствор, используемый для поддержания проходимости катетера. Существует множество типов таких растворов, однако в большинстве случаев используется гепаринизированный физиологический раствор (0,9% физиологический раствор с гепарином 20-500 МЕ/мл, «гепариновый замок»).

 Сепсис: присутствие в крови или других тканях патогенных микроорганизмов или их токсинов; состояние организма, связанное с таким присутствием.

 Тромфлебит: воспаление вен, связанное с образованием тромба (агрегация факторов крови, прежде всего тромбоцитов, фибрина и клеточных элементов, которая часто вызывает сосудистую непроходимость в месте агрегации).

 Порт сосудистого доступа: устройство постоянного доступа, имплантированное под кожу. Порт состоит из сосудистого катетера, прикрепленного к небольшому резервуару. Таким образом, можно проводить регулярный отбор крови. Устройство располагается подкожно и не создает дискомфорт для животного, так что нет необходимости во внешней защите порта. Вероятность возникновения заражения при использовании порта значительно ниже, чем при применении внешнего катетера, поскольку отсутствует выходное отверстие.

Сосудистая пункция: прокол кровеносного сосуда.

Литература:

1. Russell WMS, Burch R (1959) The Principles of Humane Experimental Technique. London: Methuen.
2. Tsukamoto H, Reidelberger RD, French SW, Largman C (1984) Long-term cannulation model for blood sampling and intragastric infusion in the rat. American Journal of Physiology - Regulatory, Integrative and Comparative Physiology 247: R595-599.
3. Wiersma J, Kastelijn J (1985) A chronic technique for high frequency blood sampling/transfusion in the freely behaving rat which does not affect prolactin and corticosterone secretion. Journal of Endocrinology 107: 285-292.
4. Suzuki K, Koizumi N, Hirose H, Hokao R, Takemura N, Motoyoshi S (1997) Blood sampling technique for measurement of plasma arginine vasopressin concentration in conscious and unrestrained rats. Laboratory Animal Science 47: 190-193.
5. Thrivikraman KV, Huot RL, Plotsky PM (2002) Jugular vein catheterization for repeated blood sampling in the unrestrained conscious rat. B ain Research Protocols 10: 84-92.
6. Guaratna PC, Kissinger PT, Kissinger CB, Gitzen JF(2004) An automated blood sampler for simultaneous sampling of systemic blood and brain microdialysates for drug absorption, distribution, metabolism and elimination studies. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods 49: 57-64.
7. Grifftihs L (2006) The impact of the AccuSampler®. Animal Technology and Welfare 5: 105-108.
8. Royo F, Björk N, Carlsson H-E, Mayo S, Hau J (2004) Impact of chronic catheterization and automated blood sampling (Accusampler) on serum corticosterone and fecal immunoreactive corticosterone metabolites and immunoglobulin A in male rats. Journal of Endocrinology 180: 145-153. http://joe.endocrinologyjournals.org/cgi/reprint/180/1/145
9. Deshmukh SV, Durston J, Shomer NH (2008) Validation of the use of nonnaive surgically catheterized rats for pharmacokinetics studies. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science 47: 41-45.
10. McGuill MW, Rowan AN (1989) Biological effects of blood loss: implications for sampling volumes and techniques. ILAR Jou nal 31: 5-18. http://dels.nas.edu/ilar_n/ilarjournal/31_4/31_4Biological.shtm

ДРУГИЕ СТАТЬИ