группа компаний "ВИВАРИЙ"

Облучение — неотъемлемый инструмент, используемый в ходе иммунологических и онкологических исследований на грызунах. Данная процедура играет крайне важную роль в рамках изучения биологических особенностей опухолей и трансплантатов, а также функционирования иммунной системы. Для достижения оптимальных характеристик моделей и улучшения результатов экспериментов крайне важно понимать биофизические и биологические факторы, которые необходимо учитывать при проведении исследований с применением облучения.

Примеры применения облучения грызунов
Облучение позволяет уничтожить преимущественно активно делящиеся клетки, включая клетки костного мозга, эпителиальные клетки кишечника и клетки других органов. Чаще всего грызунов облучают для разрушения у них костного мозга и других кроветворных клеток-предшественников (миелоаблация) в целях подавления иммунитета или перед процедурой трансплантации донорских органов в целях предотвращения реакции «трансплантат против хозяина».

Сублетальное облучение вызывает временное подавление иммунитета у животного. К данной процедуре прибегают в целях имплантации грызунам опухолей или гемопоэтических стволовых клеток.  Такие дозы облучения часто применяют у грызунов с иммунодефицитом для подавления отторжения врождённого иммунитета, в частности, NK-клетками (естественными киллерами), а также для получения химерных животных, способных производить несколько типов кроветворных клеток.

Полная миелоаблация достигается путём облучения животного смертельной дозой с последующим восстановлением его иммунной системы (то есть предотвращением его смерти) с помощью трансплантации костного мозга или гемопоэтических стволовых клеток. Трансплантация позволяет заменить иммунную систему животного на иммунную систему донора и изучить процессы, посредством которых иммунные клетки контролируют отторжение трансплантата, инфекцию, аутоиммунитет, рост опухоли и другие процессы.

Рентгеновские облучатели для исследований на грызунах
Облучение грызунов стало возможным благодаря разработке специализированных лабораторных рентгеновских облучателей, которые позволяют выполнять облучение в точных дозах безопасным и контролируемым образом. Залог успешного облучения грызунов заключается в применении надлежащей дозы облучения: чрезмерно высокие дозы неизбежно приводят к заболеваемости животных, в то время как недостаточные дозы подрывают успех эксперимента и правильную интерпретацию его результатов.

В рамках исследований на мелких животных обычно используют гамма- или рентгеновский облучатель.

• В экранированных гамма-облучателях использованы радиоактивные источники (137Cs или 60Co), которые испускают гамма-излучение с дискретной энергией в результате ядерного распада (0,662 МэВ для 137Cs и 1,173/1,332 МэВ для 60Co). Гамма-облучатели являются надёжными источниками облучения, при этом они гарантируют безопасное применение радиоизотопов и окончательное удаление радиоактивных отходов.

• В рентгеновских облучателях питание рентгеновских трубок осуществляется за счёт электричества, что обеспечивает излучение более широкого спектра энергии по сравнению с гамма-облучателями. Рентгеновские облучатели не требуют использования радиоактивных материалов, а также их можно легко включить или выключить. Возможные ограничения рентгеновских облучателей включают спектр энергии пучка и стоимость технического обслуживания рентгеновской трубки.

Сравнение гамма- и рентгеновского облучения
Крайне важно различать понятия дозировки облучения и его относительного биологического эффекта (ОБЭ) — зависимость характеристик луча и тканей, с которыми он взаимодействует. Различные ткани в организме по-разному реагируют на одну и ту же дозу облучения в зависимости от клеточных характеристик, а также состава и глубины ткани. Кроме того, эти реакции также могут различаться в зависимости от источника излучения.

Заранее невозможно точно определить ОБЭ, в силу чего необходимо выполнить его проверку с использованием различных источников облучения и посредством достижения различных целей экспериментов.

Гамма- и рентгеновские облучатели демонстрируют одинаковую эффективность в рамках достижения миелоаблации, в силу чего их часто рассматривают в качестве аналогов. Тем не менее следует проявлять осторожность в ходе валидации и воспроизведении исследований с использованием облучателей данных типов, поскольку они сопряжены с различными биологическими эффектами.

ОБЭ для рентгеновских лучей на целых 30–40% выше, нежели для гамма-излучения [1], в силу чего что при использовании рентгеновского излучения может потребоваться более низкая доза (измеряемая в Гр), нежели при использовании гамма-излучения. Частично сгладить эту разницу позволяет применение фильтров для уменьшения рентгеновских лучей низкой энергии. Тем не менее эти два источника излучения оказывают различные эффекты на определённые типы клеток [2] и связаны с различным уровнем восстановления [3].

Согласно опубликованным данным, источники гамма- и рентгеновского излучения оказывают различное воздействие на модели и сопряжены с различными побочными эффектами, в силу чего необходимо всегда выполнять валидацию и корректировку дозы.

Рекомендации относительно дозы
Дозу облучения обычно обозначают в соответствии с международной системой единиц (СИ) в грей (Гр или сГр) или рад, причём 1 рад равен 0,01 Гр. Эти единицы измерения часто используют взаимозаменяемо, в силу чего дозы облучения, используемые в рамках исследований, могут обозначать в Гр, сГр или рад.

Следует проявлять внимательность при преобразовании значения дозы из одной единицы измерения в другую, чтобы ошибочно не доставить неверную дозу.

Единицы измерения:
Поглощенное излучение: 1 Гр (грей, единицы СИ) = 100 сГр = 100 рад
 
Мощность дозы излучения: Гр/мин
Поглощенную дозу не следует путать с биологическим эффектом, измеряемым в Зв (зиверт, единица СИ) или бэр (биологический эквивалент рентгена).

Нормы дозы облучения
Другим ключевым фактором облучения грызунов является мощность дозы излучения облучателя, которую обычно указывают в Гр/мин. Данный показатель отображает продолжительность времени, в течение которого необходимо подвергать испытуемый субъект воздействию луча для достижения необходимой дозы облучения.

Мощность дозы излучения облучателя зависит от множества определяющих факторов, пренебрежение которыми приведёт к неправильному расчёту времени воздействия и дозы облучения [4]. К данным факторам относятся:
• активность источника,
• энергия рентгеновского луча,
• положение/расстояние,
• неподвижные и вращающиеся объекты,
• наличие аттенюаторов/фильтров.

Крайне важно выполнить точную калибровку облучателя и использовать его надлежащим образом. В случае неуверенности или отсутствия надлежащего опыта пользователям следует обратиться за помощью.

В облучателях на основе 137Cs или 60Co радиоактивный распад этих изотопов предсказуемо увеличивает время экспозиции в соответствии с периодом полураспада изотопов (30,17 и 5,27 лет соответственно). Например, при использовании облучателей на основе 137Cs необходимое время экспозиции увеличивается в два раза за 30 лет; то есть примерное ежегодное увеличение времени составляет 2,3 %.

Стандартные дозы облучения и рекомендации
Дозу следует устанавливать с учётом ряда факторов, которые определяют степень воздействия излучения на используемую модель. В рамках валидации новых программ исследований необходимо учитывать следующее:

• Источник излучения. При использовании рентгеновского излучения могут потребоваться более низкие дозы, нежели при использовании гамма-излучения. Кроме того, на дозы могут влиять выходная мощность рентгеновской трубки и наличие экранирования.
• Линия используемых моделей. При использовании мышей линий BALB/c и SCID (с тяжёлым комбинированным иммунодефицитом) необходимо применять более низкие дозы облучения.
• Возраст. Может потребоваться снижение или увеличение дозы, если модели находятся в возрасте повышенной чувствительности или повышенной резистентности соответственно [5]. Крайне важно помнить о больших изменениях радиочувствительности у мышей в возрасте 1–3 месяцев от роду. По мере взросления мышей выделяют следующие особенности радиочувствительности:
- новорождённые: относительная резистентность;
- отлучение от матери (20–30 дней): наибольшая восприимчивость;
- начало зрелого возраста (3–4 месяца): наибольшая резистентность;
- зрелый возраст (от 6 месяцев): снижение резистентности по мере увеличения возраста.
• Состояние здоровья. Наличие проблем со здоровьем (обусловленных, например, наличием патогенов или условно-патогенных микроорганизмов, стрессом, плохим питанием и основными заболеваниями) способствует снижению переносимых доз.
• Время суток. У мышей отмечается различная восприимчивость к облучению в зависимости от времени суток [6].
• Многократные дозы. Доказано, что фракционирование тотальной дозы посредством введения двух половинных доз с интервалом 3–4 часа, снижает осложнения облучения, обеспечивая при этом эквивалентную миелоаблацию у мышей линии C57BL/6 [7].

Воздействие облучения на мышей в зависимости от линии животных
Представлены надёжные доказательства различия в радиочувствительности разных инбредных линий мышей  [8-14], которые необходимо учитывать в моделях, используемых для облучения:

• Мыши линии BALB/c особенно чувствительны к воздействию облучения из-за неизвестного аутосомно-рецессивного генетического локуса [10,11] и не способны переносить дозу облучения, которую переносят мыши линии C57BL/6.
• Гибриды первого поколения F1, полученные в результате реципрокного скрещивания C57BL/6 x BALB/c, также демонстрируют устойчивость, аналогичную родительской линии C57BL/6. Однако в результате дальнейшего скрещивания этих гибридов получают поколения F2 и F3 с различной восприимчивостью к облучению.

Генетические вариации с точки зрения поражения радиоактивным излучением могут создавать проблему при использовании мышей, полученных в результате скрещивания различных инбредных линий (например, трансгенных или генетически модифицированных мышей), что приводит к непредсказуемым реакциям на облучение в исследуемых когортах животных. В рамках исследований с применением облучения рекомендуется использовать мышей линий с установленными генетическими характеристиками.

Мыши с дефектными сигнальными путями репарации ДНК наиболее восприимчивы к поражению в результате облучения. Ярким примером таких мышей являются линии SCID, у которых мутация в гене Prkdc приводит к нарушению репарации двухцепочечного разрыва ДНК. Мыши с мутацией Prkdcscid обладают крайне высокой восприимчивостью к облучению, в силу чего при их применении следует использовать значительно меньшие дозы, нежели при использовании мышей других линий [14] (например, C.B-17 scid, ICR scid, NOD scid, scid-beige и NOG).

Относительная радиочувствительность различных линий мышей: 

                                           129S ≤ SJL ≤ C3H ≤ C57BL/6 < 

Диапазоны стандартных доз для различных линий мышей

Примечание: 1 Гр = 100 сГр = 100 рад

Стандарты здоровья и облучение грызунов
Как правило, облучение вызывает у мышей угнетение иммунитета. В зависимости от дозировки этот эффект может быть временным (продолжающимся до момента восстановления кроветворных клеток за счёт внутренних резервов или трансплантации) или необратимым.

В период иммуносупрессии мыши восприимчивы к оппортунистическим инфекциям, которые могут влиять на выживаемость или характеристики модели. Особую опасность представляет бактерия Pseudomonas aeruginosa, которая может перемещаться по кишечнику у облучённых животных, провоцируя развитие бактериемии и системных воспалительных реакций [15].

Эти и другие условно-патогенные осложнения облучения можно избежать посредством отбора животных с соответствующими стандартами здоровья, применения профилактической антибиотикотерапии и соблюдения правил асептики.

Практические рекомендации относительно облучения грызунов
• Убедитесь, что облучатели правильно откалиброваны, а пользователи прошли соответствующее обучение.
• Выполните валидацию определённых источников излучения и доз в соответствии с биологическими реакциями и характеристиками модели.
• Убедитесь в том, что учтены все переменные биологического характера (линия, возраст, состояние здоровья животных) и скорректируйте дозы облучения для получения оптимальных ответов и приемлемых побочных эффектов.
• Укажите тип используемого облучателя, общую дозу облучения и нормы дозы облучения в рамках исследований.
• Укажите возраст и состояние здоровья животных на момент облучения.
• Проконсультируйтесь с ветеринаром вашего учреждения для получения информации о характеристиках доступных облучателей для определённых исследований.

Источники:
1. Storer JB, Harris PS, Furchner JE, Langham WH. The relative biological effectiveness of various ionizing radiations in mammalian systems. Radiat Res. 1957 Feb;6(2):188-288.
2. Scott BR, Gott KM, Potter CA, Wilder J. A Comparison of In Vivo Cellular Responses to Cs-137 Gamma Rays And 320-kV X Rays. Dose Response. 2013 Jan 18;11:444-59.
3. Gibson BW, Boles NC, Souroullas GP, Herron AJ, Fraley JK, Schwiebert RS, Sharp JJ, Goodell MA. Comparison of Cesium-137 and X-ray Irradiators by Using Bone Marrow Transplant Reconstitution in C57BL/6J Mice. Comp Med. 2015 Jun;65(3):165-72.
4. Yoshizumi T, Brady SL, Robbins ME, Bourland JD. Specific issues in small animal dosimetry and irradiator calibration. Int J Radiat Biol. 2011 Oct;87(10):1001-10.
5. Spalding JF, Trujillo TT. Radiosensitivity of mice as a function of age. Radiat Res. 1962 Feb;16:125-9.
6. Pizzarello DJ, Witcofski RL. A possible link between diurnal variations in radiation sensitivity and cell division in bone marrow of male mice. Radiology. 1970 Oct;97(1):165-7.
7. Cui YZ, Hisha H, Yang GX, Fan TX, Jin T, Li Q, Lian Z, Ikehara S. Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice. Bone Marrow Transplant. 2002 Dec;30(12):843-9.
8. Kallman RF, Kohn HI. The influence of strain on acute x-ray lethality in the mouse. I. LD50 and death rate studies. Radiat Res. 1956 Oct;5(4):309-17.
9. Grahn D, Hamilton KF. Genetic Variation in the Acute Lethal Response of Four Inbred Mouse Strains to Whole Body X-Irradiation. Genetics. 1957 May;42(3):189-98.
10. Grahn D. Acute Radiation Response of Mice from a Cross between Radiosensitive and Radioresistant Strains. Genetics. 1958 Sep;43(5):835-43.
11. Mori N, Okumoto M, Morimoto J, Imai S, Matsuyama T, Takamori Y, Yagasaki O. Genetic analysis of susceptibility to radiation-induced apoptosis of thymocytes in mice. Int J Radiat Biol. 1992 Aug;62(2):153-9.