СУЩЕСТВЕННЫЕ ФАКТОРЫ ПРИ ОБЛУЧЕНИИ ГРЫЗУНОВ
Облучение — неотъемлемый инструмент, используемый в ходе иммунологических и онкологических исследований на грызунах. Данная процедура играет крайне важную роль в рамках изучения биологических особенностей опухолей и трансплантатов, а также функционирования иммунной системы. Для достижения оптимальных характеристик моделей и улучшения результатов экспериментов крайне важно понимать биофизические и биологические факторы, которые необходимо учитывать при проведении исследований с применением облучения.
Примеры применения облучения грызунов
Облучение позволяет уничтожить преимущественно активно делящиеся клетки, включая клетки костного мозга, эпителиальные клетки кишечника и клетки других органов. Чаще всего грызунов облучают для разрушения у них костного мозга и других кроветворных клеток-предшественников (миелоаблация) в целях подавления иммунитета или перед процедурой трансплантации донорских органов в целях предотвращения реакции «трансплантат против хозяина».
Сублетальное облучение вызывает временное подавление иммунитета у животного. К данной процедуре прибегают в целях имплантации грызунам опухолей или гемопоэтических стволовых клеток. Такие дозы облучения часто применяют у грызунов с иммунодефицитом для подавления отторжения врождённого иммунитета, в частности, NK-клетками (естественными киллерами), а также для получения химерных животных, способных производить несколько типов кроветворных клеток.
Полная миелоаблация достигается путём облучения животного смертельной дозой с последующим восстановлением его иммунной системы (то есть предотвращением его смерти) с помощью трансплантации костного мозга или гемопоэтических стволовых клеток. Трансплантация позволяет заменить иммунную систему животного на иммунную систему донора и изучить процессы, посредством которых иммунные клетки контролируют отторжение трансплантата, инфекцию, аутоиммунитет, рост опухоли и другие процессы.
Рентгеновские облучатели для исследований на грызунах
Облучение грызунов стало возможным благодаря разработке специализированных лабораторных рентгеновских облучателей, которые позволяют выполнять облучение в точных дозах безопасным и контролируемым образом. Залог успешного облучения грызунов заключается в применении надлежащей дозы облучения: чрезмерно высокие дозы неизбежно приводят к заболеваемости животных, в то время как недостаточные дозы подрывают успех эксперимента и правильную интерпретацию его результатов.
В рамках исследований на мелких животных обычно используют гамма- или рентгеновский облучатель.
• В экранированных гамма-облучателях использованы радиоактивные источники (137Cs или 60Co), которые испускают гамма-излучение с дискретной энергией в результате ядерного распада (0,662 МэВ для 137Cs и 1,173/1,332 МэВ для 60Co). Гамма-облучатели являются надёжными источниками облучения, при этом они гарантируют безопасное применение радиоизотопов и окончательное удаление радиоактивных отходов.
• В рентгеновских облучателях питание рентгеновских трубок осуществляется за счёт электричества, что обеспечивает излучение более широкого спектра энергии по сравнению с гамма-облучателями. Рентгеновские облучатели не требуют использования радиоактивных материалов, а также их можно легко включить или выключить. Возможные ограничения рентгеновских облучателей включают спектр энергии пучка и стоимость технического обслуживания рентгеновской трубки.
Сравнение гамма- и рентгеновского облучения
Крайне важно различать понятия дозировки облучения и его относительного биологического эффекта (ОБЭ) — зависимость характеристик луча и тканей, с которыми он взаимодействует. Различные ткани в организме по-разному реагируют на одну и ту же дозу облучения в зависимости от клеточных характеристик, а также состава и глубины ткани. Кроме того, эти реакции также могут различаться в зависимости от источника излучения.
Заранее невозможно точно определить ОБЭ, в силу чего необходимо выполнить его проверку с использованием различных источников облучения и посредством достижения различных целей экспериментов.
Гамма- и рентгеновские облучатели демонстрируют одинаковую эффективность в рамках достижения миелоаблации, в силу чего их часто рассматривают в качестве аналогов. Тем не менее следует проявлять осторожность в ходе валидации и воспроизведении исследований с использованием облучателей данных типов, поскольку они сопряжены с различными биологическими эффектами.
ОБЭ для рентгеновских лучей на целых 30–40% выше, нежели для гамма-излучения [1], в силу чего что при использовании рентгеновского излучения может потребоваться более низкая доза (измеряемая в Гр), нежели при использовании гамма-излучения. Частично сгладить эту разницу позволяет применение фильтров для уменьшения рентгеновских лучей низкой энергии. Тем не менее эти два источника излучения оказывают различные эффекты на определённые типы клеток [2] и связаны с различным уровнем восстановления [3].
Согласно опубликованным данным, источники гамма- и рентгеновского излучения оказывают различное воздействие на модели и сопряжены с различными побочными эффектами, в силу чего необходимо всегда выполнять валидацию и корректировку дозы.
Рекомендации относительно дозы
Дозу облучения обычно обозначают в соответствии с международной системой единиц (СИ) в грей (Гр или сГр) или рад, причём 1 рад равен 0,01 Гр. Эти единицы измерения часто используют взаимозаменяемо, в силу чего дозы облучения, используемые в рамках исследований, могут обозначать в Гр, сГр или рад.
Следует проявлять внимательность при преобразовании значения дозы из одной единицы измерения в другую, чтобы ошибочно не доставить неверную дозу.
Единицы измерения:
Поглощенное излучение: 1 Гр (грей, единицы СИ) = 100 сГр = 100 рад
Мощность дозы излучения: Гр/мин
Поглощенную дозу не следует путать с биологическим эффектом, измеряемым в Зв (зиверт, единица СИ) или бэр (биологический эквивалент рентгена).
Нормы дозы облучения
Другим ключевым фактором облучения грызунов является мощность дозы излучения облучателя, которую обычно указывают в Гр/мин. Данный показатель отображает продолжительность времени, в течение которого необходимо подвергать испытуемый субъект воздействию луча для достижения необходимой дозы облучения.
Мощность дозы излучения облучателя зависит от множества определяющих факторов, пренебрежение которыми приведёт к неправильному расчёту времени воздействия и дозы облучения [4]. К данным факторам относятся:
• активность источника,
• энергия рентгеновского луча,
• положение/расстояние,
• неподвижные и вращающиеся объекты,
• наличие аттенюаторов/фильтров.
Крайне важно выполнить точную калибровку облучателя и использовать его надлежащим образом. В случае неуверенности или отсутствия надлежащего опыта пользователям следует обратиться за помощью.
В облучателях на основе 137Cs или 60Co радиоактивный распад этих изотопов предсказуемо увеличивает время экспозиции в соответствии с периодом полураспада изотопов (30,17 и 5,27 лет соответственно). Например, при использовании облучателей на основе 137Cs необходимое время экспозиции увеличивается в два раза за 30 лет; то есть примерное ежегодное увеличение времени составляет 2,3 %.
Стандартные дозы облучения и рекомендации
Дозу следует устанавливать с учётом ряда факторов, которые определяют степень воздействия излучения на используемую модель. В рамках валидации новых программ исследований необходимо учитывать следующее:
• Источник излучения. При использовании рентгеновского излучения могут потребоваться более низкие дозы, нежели при использовании гамма-излучения. Кроме того, на дозы могут влиять выходная мощность рентгеновской трубки и наличие экранирования.
• Линия используемых моделей. При использовании мышей линий BALB/c и SCID (с тяжёлым комбинированным иммунодефицитом) необходимо применять более низкие дозы облучения.
• Возраст. Может потребоваться снижение или увеличение дозы, если модели находятся в возрасте повышенной чувствительности или повышенной резистентности соответственно [5]. Крайне важно помнить о больших изменениях радиочувствительности у мышей в возрасте 1–3 месяцев от роду. По мере взросления мышей выделяют следующие особенности радиочувствительности:
- новорождённые: относительная резистентность;
- отлучение от матери (20–30 дней): наибольшая восприимчивость;
- начало зрелого возраста (3–4 месяца): наибольшая резистентность;
- зрелый возраст (от 6 месяцев): снижение резистентности по мере увеличения возраста.
• Состояние здоровья. Наличие проблем со здоровьем (обусловленных, например, наличием патогенов или условно-патогенных микроорганизмов, стрессом, плохим питанием и основными заболеваниями) способствует снижению переносимых доз.
• Время суток. У мышей отмечается различная восприимчивость к облучению в зависимости от времени суток [6].
• Многократные дозы. Доказано, что фракционирование тотальной дозы посредством введения двух половинных доз с интервалом 3–4 часа, снижает осложнения облучения, обеспечивая при этом эквивалентную миелоаблацию у мышей линии C57BL/6 [7].
Воздействие облучения на мышей в зависимости от линии животных
Представлены надёжные доказательства различия в радиочувствительности разных инбредных линий мышей [8-14], которые необходимо учитывать в моделях, используемых для облучения:
• Мыши линии BALB/c особенно чувствительны к воздействию облучения из-за неизвестного аутосомно-рецессивного генетического локуса [10,11] и не способны переносить дозу облучения, которую переносят мыши линии C57BL/6.
• Гибриды первого поколения F1, полученные в результате реципрокного скрещивания C57BL/6 x BALB/c, также демонстрируют устойчивость, аналогичную родительской линии C57BL/6. Однако в результате дальнейшего скрещивания этих гибридов получают поколения F2 и F3 с различной восприимчивостью к облучению.
Генетические вариации с точки зрения поражения радиоактивным излучением могут создавать проблему при использовании мышей, полученных в результате скрещивания различных инбредных линий (например, трансгенных или генетически модифицированных мышей), что приводит к непредсказуемым реакциям на облучение в исследуемых когортах животных. В рамках исследований с применением облучения рекомендуется использовать мышей линий с установленными генетическими характеристиками.
Мыши с дефектными сигнальными путями репарации ДНК наиболее восприимчивы к поражению в результате облучения. Ярким примером таких мышей являются линии SCID, у которых мутация в гене Prkdc приводит к нарушению репарации двухцепочечного разрыва ДНК. Мыши с мутацией Prkdcscid обладают крайне высокой восприимчивостью к облучению, в силу чего при их применении следует использовать значительно меньшие дозы, нежели при использовании мышей других линий [14] (например, C.B-17 scid, ICR scid, NOD scid, scid-beige и NOG).
Относительная радиочувствительность различных линий мышей:
129S ≤ SJL ≤ C3H ≤ C57BL/6 <
Диапазоны стандартных доз для различных линий мышей
| Стандартная доза (сГр) | |
| C57BL/6 |
Полная миелоаблация (летальная доза): Частичная миелоаблация (сублетальная доза): |
| BALB/c |
Полная миелоаблация (летальная доза): Частичная миелоаблация (сублетальная доза): |
| SCID | Иммуносупрессия: 50–250 |
Примечание: 1 Гр = 100 сГр = 100 рад
Стандарты здоровья и облучение грызунов
Как правило, облучение вызывает у мышей угнетение иммунитета. В зависимости от дозировки этот эффект может быть временным (продолжающимся до момента восстановления кроветворных клеток за счёт внутренних резервов или трансплантации) или необратимым.
В период иммуносупрессии мыши восприимчивы к оппортунистическим инфекциям, которые могут влиять на выживаемость или характеристики модели. Особую опасность представляет бактерия Pseudomonas aeruginosa, которая может перемещаться по кишечнику у облучённых животных, провоцируя развитие бактериемии и системных воспалительных реакций [15].
Эти и другие условно-патогенные осложнения облучения можно избежать посредством отбора животных с соответствующими стандартами здоровья, применения профилактической антибиотикотерапии и соблюдения правил асептики.
Практические рекомендации относительно облучения грызунов
• Убедитесь, что облучатели правильно откалиброваны, а пользователи прошли соответствующее обучение.
• Выполните валидацию определённых источников излучения и доз в соответствии с биологическими реакциями и характеристиками модели.
• Убедитесь в том, что учтены все переменные биологического характера (линия, возраст, состояние здоровья животных) и скорректируйте дозы облучения для получения оптимальных ответов и приемлемых побочных эффектов.
• Укажите тип используемого облучателя, общую дозу облучения и нормы дозы облучения в рамках исследований.
• Укажите возраст и состояние здоровья животных на момент облучения.
• Проконсультируйтесь с ветеринаром вашего учреждения для получения информации о характеристиках доступных облучателей для определённых исследований.